3羊膜腔

4卵黄囊

5脑内

6静脉

很多哺乳类病毒不在鸡胚上生长（不适应）→牢记！！实验需掌握

鸡胚培养病毒的优点和缺点

优点：经济、简便、鸡胚易得

缺点：

1有些鸡胚带有母源抗体

2也可能带有病毒

3很多病毒在鸡胚中不生长

2.2.3 细胞培养：

1将离体活组织块或分流的活细胞加以培养统称为组织培养，后者又称单层细胞培养。

2细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。

细胞培养的特点：

（1）细胞的生理特性基本一致

（2）对病毒的感染性一致

（3）没有实验动物的个体差异

（4）重复性好

（5）与实验动物相比，通过观察细胞病变或结合免疫学技术检测判断结果。

（6）可通过病毒细胞培养产生的空斑进行克隆纯化病毒。

细胞培养的类型

根据细胞的来源、染色体特征及传代次数，可分为三种类型:

（1）原代细胞

（2）二倍体细胞株

（3）传代细胞系

原代细胞：

1动物新鲜离体组织块（剪成小块）经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，再生长与培养器皿中。

2有人把培养的第 1 代细胞与传 10代以内细胞统称为原代细胞。

3分离病毒最为敏感，尤其是本动物的原代细胞。

二倍体细胞株：

1将长成的单层原代细胞消化分散成单个细胞继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样保持其二倍体型的染色体，称为二倍体细胞。

2如：猪肾细胞系（pK-15）、犬肾细胞系mdcK。

3可传至一百代左右

4用于病毒分离和疫苗制备

传代细胞系：

1能在体外持续增殖传代的细胞系，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而来

2方便易得

3用于病毒的分离鉴定和抗病毒药物筛选研究。

常用的细胞培养类型

原代细胞:恒河猴肾细胞、人胚肾、肺等细胞，鸡胚成纤维细胞

二倍体细胞株:猪肾细胞系（pK-15）、恒河猴胚细胞株（hL-8）、犬肾细胞系

传代细胞系:hela 细胞、detroit 细胞（胸骨髓细胞系），chang c\/I\/L\/K（人结膜 c、肠 I、肝 L 与肾 K 细胞系），Vero（绿猴肾细胞系），bhK-21（幼地鼠肾细胞系）

3.病毒理化特性的测定

（1）病毒核酸型鉴定（单股\/双股 dNA\/RNA 正链\/负链 新病毒→逐渐缩小范围）

1卤化核苷酸法→检测为 dNA 还是 RNA 病毒

2放线菌素 d 法

3吖啶橙（Ao）染色法

4绿豆芽酶：

该酶可降解单核酸，可以测定核酸的股数

（2）耐酸性试验

（3）脂溶性试验

（4）耐热性试验等

4.病毒的血清学和分子生物学鉴定

1病毒分离后，可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体，对分离毒株进行血清学鉴定，已确定病毒的种类、血清型及其亚型。

2分子生物学技术鉴定病毒

第二节 病毒感染单位的测定

1测定样本中病毒的浓度，即病毒的滴度是病毒学中最重要的技术之一。

2病毒滴度可以通过用稀释的病毒接种细胞培养、鸡胚或实验动物，检测其增殖情况而确定。

3常用于病毒滴度测定的技术有空斑试验、终点稀释法等。

终点稀释法：

（1）用途：

1测定病毒滴度

2确定病毒对动物的毒力或毒价

（2）方法：

将病毒做系列稀释，选 4~6 个稀释度，接种一定数量的细胞、鸡胚或动物，每个稀释度做 3~6 个重复

→问 tcId50、Id50、Ld50、ELd50、EId50

第三节 病毒颗粒的检测

1电镜技术常用于直接检测病毒颗粒

2用血凝试验和病毒酶活性测定

电镜技术：

1最直观观察病毒颗粒的方法。但 Em 检测样本中必须有一定量的病毒颗粒，如少于 107\/ml 则不易检出

2可用磷钨酸盐等重金属盐直接做负染而后观察，适用于观察病毒表面结构。

3器官组织样本则须做超薄切片后再做负染观察。可观察细胞内的病毒结构，如冠状病毒、逆转录病毒在组织中出芽的病毒颗粒等。